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    免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)相關(guān)事項(xiàng)要了解!

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-06  點(diǎn)擊次數(shù): 1176次
       常規(guī)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類:一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō),超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè);后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合,通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記,如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶(APH),潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
      免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的相關(guān)事項(xiàng):
      1.細(xì)胞密度
      一般來(lái)說(shuō),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率,過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效果。
      2.細(xì)胞狀態(tài)
      這點(diǎn)非常關(guān)鍵,很多時(shí)候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此,為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性,應(yīng)盡量使用適度傳代的細(xì)胞系,并在不同次實(shí)驗(yàn)時(shí)保持細(xì)胞傳代次數(shù)的一致性。盡量選擇無(wú)支原體污染的細(xì)胞,支原體污染是肉眼看不到的,可用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),確保無(wú)支原體污染。
      3.細(xì)胞種類
      不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時(shí)所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的,不能一種體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
      4.DNA純度
      在制備高純度DNA時(shí),還需要對(duì)DNA進(jìn)行內(nèi)毒素的去除,內(nèi)毒素的存在會(huì)造成細(xì)胞毒性,嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染效率,現(xiàn)在市面上有很多去除內(nèi)毒素的DNA純化試劑盒可供選擇。
      5.轉(zhuǎn)染試劑
      脂質(zhì)體試劑的毒性大,盡量選用脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑。另外,在大規(guī)模使用前,需進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑和核酸優(yōu)比例的摸索。
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